CopG Repressor-Protein

John DePowell, '02 und
Timur Senguen, '03

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Chime Index

Contents:

I. Einführung

Die Replikation bakterieller Plasmide ist hochgradig reguliert und stabile Erhaltung der Plasmide im befallenen Organismus hängt von einer konstanten Anzahl von Plasmidkopien ab.  Ohne eine Regulation der Anzahl der Plasmidkopien würden zu viele Plasmide  produziert und dadurch die dringend benötigten Resourcen, die für andere Prozess im Bakterium benötigt werden, verbraucht. Die Replikation wird durch die Verfügbarkeit eines rep-genkodierten Initiators des Replikationsprotein (Rep) kontrolliert.  Bei dem Streptokokken-Plasmid 5536 bp pMV158  wird die Synthese des RepB-Initiatorproteins  durch die Produkte zweier Gene, rnaII und copG, geregelt.

Das copG-Gen kodiert für den Transkriptions-Repressor CopG.  Dieses Protein ist der kleinste natürliche Transkriptions-Repressor, der zur Zeit bekannt ist.
Es wurde als Homodimer, das aus zwei  45 Aminosäuren langen identischen Untereinheiten besteht, identifiziert .  Das Protein unterdrückt seine eigene Produktion und die Produktion des RepB-Proteins, indem es an die copG-repB-Promotorregion bindet.  Durch diese Bindung wird die DNS über den Verlauf von vier Windungen in einem Winkel von  60º gebogen .  Bindung des Repressors an die DNS kann möglicherweise verhindern, dass die RNA-Polymerase des infizierten Organismus an die DNS binden kann. 

II. Generelle Struktur

CopG ist ein Dimer zweier identischer Polypeptidketten, A und B, beide 45 Aminosäuren lang <>.  Beide Monomer haben ein Helix-Turn-Helix Motiv <> welches durch intramolekulare hydrophobe Blöcke stabilisiert wird, die aus 7 Aminosäurenreste in beiden Seitenketten bestehen: Leu17, Met20, und Met24 (von Helix A) und Leu26, Met 31,Ile32, und Val34 (von der hinteren Schleife und von Helix B) <>.  Das Dimer enthält 20 Wasserstoffbrücken, 56 van der Waals Kontakte und eine Ionenbindung.  Die Assoziation der beiden Moleküle führt zu der Bildung einer antiparallelen zweisträngigen gedrehten Faltblattstruktur, basierend auf 10 Wasserstoffbrücken zwischen den Hauptketten  beider Monomer von Met1 zu Glu11  <>.  Dieses Faltblatt führt zusammen mit dem HTH  zu einem Faltblatt-Helix-Helix Motiv für beide Monomer des symmetrischen Homodimer. 

III. CopG-DNS-Komplex

Der Komplex aus CopG und doppelsträngiger DNS ist ein Tetramer,<> das sich durch die Assoziation zweier Dimere bildet  <>.  Die Bindung des CopG-Proteins an die  DNS wird zwischen dem N-terminalen b-Faltblatt und den DNS Basen einerseits <>, und zwischen den Phosphatgruppen der DNS-Rückgrats über Seitenketten am Amino-Ende der Helix B beider Monomere andererseits hergestellt  <>.  Durch diesen Prozess wird die DNS in einen Winkel von 60º gebogen.  Diese Biegung wird durch die Kompression sowohl der kleinen als auch der grossen Furche auf der dem Protein zugewandten Seite der DNS erreicht <>.  Die kleine Furche ist  im Zentrum des Operators extrem eng (1.9 A); die grosse Furche wird auf ungefähr  3/4 (8.6 A) ihrer üblichen Grösse (11.7 A) komprimiert .  Das DNS-Rückgrat folgt einer sanften Biegung außer an einer Stelle nahe dem Zentrum des Operators, wo die kleine Furche komprimiert ist und die Basenpaare etwas geneigt sind <>.  Dieser Link öffnet ein neues Fenster mit der Cartoon-Darstellung des Tetramer-DNS-Komplexes4, Fig. 2D
from Gomis-Ruth, F.X. et al. . Zurück zu der füheren Darstellung des Tetramer-DNS-Komplexes.

IV. Basen-Erkennungs-Kontakte

Das CopG Molekül bindet  über das N-terminale b-Faltblatt an die Basen der DNS.  DNS und CopG  haben beide zweifache Symmetrieachsen, aber jedes der beiden b-Faltblätter des CopG bindet an verschiedene Basen, die nicht der zweifachen Symmetrie der DNS-Sequenz  folgen.  Die Asymmetrie der Erkennungkontakte der beiden b-Faltblätter wird durch die verschiedenen Interaktionen der  Thr6-Reste beider Faltblätter verdeutlicht.  Zum Beispiel besteht eine Wasserstoffbrücke zwischen Thr6A   und Thy-6, während Thr6B eine Wasserstoffbrücke zu Cyt-5 ausbildet <>.  Andere Wasserstoffbrücken werden zwischen Arg4B und Thy-7 <> sowie zwischen Arg4A und Gua-4 und Gua-5 ausgebildet <>.  Es gibt auch Stapel-Interaktionen, wobei eine Methylgruppe von Thy-3  zwischen  den Methylgruppen von Thr6B und Thr8B steckt <>.

V. Rückgrat-Interaktionen

Des Weiteren gibt es Kontakte zwischen CopG und dem DNS-Rückgrat.  Diese Interaktionen hängen nicht direkt von der DNS Sequenz ab. Sie bestehen als H-Brücken zwischen den Seitenketten von Thr8, Ser29 und Lys28 beider Monomere mit den DNS Phosphatgruppen <>.  Zusätzlich etablieren einige Phosphate des DNS-Rückgrats Kontakte zu den  Stickstoffatomen der alpha-Aminogruppen von Lys28A und Ser29A.  Diese zwei Aminosäuren befinden sich auf der ersten Drehung der Helix B direkt hinter der Schleife des HTH-Motivs <>.  Dadurch wird einer Phosphatgruppe eine N-Kappe aufgesetzt und befindet sich in der Achse des Helixdipoles.  Im Monomer B zeigt Helix B mit seinem Aminoende auf die DNS Phosphatgruppe, aber in diesem Falle bestehen keine H-Brücken.
 


VI. Implikationen für die Mitglieder der COP Familie von Plamid-Repressoeren

CopG ist der Prototyp für eine ganze Familie von Cop-Repressoren plasmidischer Herkunft.  Konsenzanalysen zeigen, dass die Strukuren von  14 Mitgliedern dieser Familie  mit der Struktur, die gerade beschrieben wurde, kompatibel sind; Unterschiede in der Länge sind durch längere Amino- und Carboxyl-Enden bestimmt.  Alle Mitglieder der Familie zeigen bestimmte Ähnlichkeiten: Sie zeigen die gleiche durch Glycin verursachten Schleife, die die beiden Helices des HTH-Motivs verbindet, und ähnliche  Aminosäurereste an wichtigen Positionen, wie der hydrophoben Tasche.  Es wird angenommen, dass, wegen der Ähnlichkeiten, alle Mitglieder der Cop-Familie  dasselbe RHH-Motiv teilen.  Zudem zeigen ein paar nicht verwandte hypothetische Genprodukte von Bakterien und Viren signifikante Ähnlichkeiten in der Funktion und denselbe Aufbau der  Domäne wie die Cop-Familie.
 

VII. Literatur

del Solar,G.H.,  Giraldo,R.,  Ruiz-Echevarria,M.J.,  Espinosa,M.,  Diaz-Orejas,R.  (1998) Replication and control of circular bacterial plasmids.  Microbiol. and Mol. Biol. Rev., 62, 434-464.

del Solar,G.H.,   perez-Martin,J. and Espinosa,M. (1995) Replication control of plasmid pLS1: efficient regulation of plasmid copy number is exerted by the combined action of two plasmid components, CopG and RNA II.  Mol. Microbiol., 18, 913-924.

Gomis-Ruth,F.X.,   Sola,M.,   Perez-Luque,R.,   Acebo,P.,  Alda,M.T.,  Gonzalez,A.,  Espinosa,M.,  del Solar,G., and Coll,M.  (1998) Overexpression, purification, crystallization, and preliminary X-ray diffraction analysis of the pMV158-encoded plasmid transcriptional repressor protein CopG.  FEBS Lett., 425, 161-165.

Gomis-Ruth,F.X.,   Sola,M.,  Acebo,P.,  Parraga,A.,  Guasch,A.,  Eritja,R.,  Gonzalez,A.,  Espinosa,M.,  del Solar,G.,  Coll,M.  (1998)  The structure of plasmid-encoded transcriptional repressor CopG unliganded and bound to its operator.  The EMBO Journal, 17, 7404-7415.